荧光定量PCR入门介绍（含定量判断）

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发表时间：2022-02-11 16:10

由于操作简单、快速、精准等的优点，荧光PCR方法检测病原体已成为常规的检测技术之一，但对于刚开始学习，缺乏经验的我们，心中或会有些疑问，比如荧光定量PCR技术是什么？荧光定量PCR曲线的每个参数代表什么？我们又怎样去分析扩增结果？不急，今天小编就帮你一一解答，带你入门。

实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR ），简称RT-qPCR，是通过对PCR反应的每一次循环产物荧光信号的实时监测，从而实现对起始模板定性及定量的分析的一种技术方法。

图1

扩增曲线的每个时期

基线期：扩增产物少，信号被背景信号掩盖；
指数期：PCR原料充足，产物以2n指数增长；
线性期：原料部分消耗后，产物增长速度下降；
平台期：原料接近耗尽，产物增长速度极慢甚至完全不增长。

荧光定量PCR里的几个重要参数

基线（Baseline）：指在PCR扩增反应的最初的数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线的线。

阈值（threshold）:一般将反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，一般设置是3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光阈值设定在PCR扩增的指数期（默认阈值=基线（背景）信号标准差×10）。

CT值（Cyclethreshold）：表示每个PCR反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多（即样本核酸浓度越高），CT值越小，反之亦然。

（注意:只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与与起始模板量之间存在线性关系，我们可以在这个阶段进行定量分析。仪器上出现的CT值只能定性判断样本的阴阳性，定量分析需要运用标准曲线。）

图2

结果分析（如图2）

标准曲线：利用已知拷贝数的标准品，按10倍浓度稀释五个成梯度，做出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。

斜率：从线性方程上看，计算公式为斜率=-1/lg(1+扩增效率)。如果从标准曲线上得到斜率（ -3.3），就可以算出扩增效率（ 0.99）。一般来讲 PCR扩增效率在90%-110%都是可以用于数据分析的。效率低于 100%，是由于PCR 反应中存在抑制因素；而高于 100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。

相关系数R^2：用以反映变量之间相关关系密切程度的统计指标。相关系数在0.99以上，得到的斜率才比较有意义。当然，样本量一定要足够，比如做标准曲线时，最少要有四个点以上，即四个不同的初始浓度，结果才可信。

因此，我们只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线（标曲）上计算出该样品的起始拷贝数。