教你如何解决qPCR异常曲线【第二课】

实时荧光定量PCR（qPCR）方法因其灵敏、特异、精准等优点，已成为常规检测病原体的技术之一。其中冻干型的qPCR试剂，能在常温条件下储运，使用时仅需加入复溶液和核酸模板即可上机检测，避免了繁琐的配制程序，其操作更简便，灵敏度更高，性能也更稳定，在动物疫病诊断等领域有着广泛的应用。

在日常检测过程中我们或多或少都会遇到扩增曲线异常的情况，给结果判读造成一定困难。关于曲线异常的解决方案，小编早前已整理过一期（详情：https://mp.weixin.qq.com/s/xcwXvzdw_i7En5ZFYLmsDQ），今天，小编再次收集整理了常见qPCR异常曲线的解决方案供大家参考，希望帮助大家不再受异常曲线的困扰。

首先我们来回顾一下正常的扩增曲线

标准S型扩增曲线

1. 一般呈S型，标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势；

2. 曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好；

3. 曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高。

1.1阴性对照有扩增，末尾起跳

原因分析：

(1) 实验操作过程存在交叉污染；

(2) 实验室环境存在阳性DNA气溶胶污染。

解决方案：

(1) 清理工作台面后，复检，排除交叉污染的可能性。若复检阴性正常，则前次实验可能为交叉污染造成；若复检仍为阳性，则实验环境可能存有阳性DNA气溶胶污染；

(2) 实验室出现阳性DNA气溶胶污染的情况下，应及时做好以下几点工作：a）对实验室进行通风处理，通风时间需要一天以上，通风期间可开展后续其它清理工作；b）清洁仪器设备/工作台面和地面，仪器设备表面可用纯净水多次擦拭（注：不可用84水擦拭，防止腐蚀仪器），工作台面和地面可以用10倍稀释的84水擦拭，然后再用自来水擦拭，清除84残留；c）有条件的实验室可用DNA清除液处理DNA污染；d）上述工作完成以后，使用新的耗材开展实验；

(3) 实验操作过程中尽量小心，防止溶液溅出，实验操作结束后及时清理工作台面和实验废弃物，不打开反应完的PCR管，PCR反应结束后，用一次性塑料袋或一次性塑料手套包裹PCR管，与其它实验废弃物一起清理，不得做高温高压处理；

(4) 定期对工作台面和实验室进行消毒。

1.2阳性对照（或内标）没有扩增，或者CT值大于预期

原因分析：

(1) 操作或移液器原因，即未加/少加阳性对照（或者样品不含内标DNA成分）；

(2) 仪器温控系统损坏；

(3) 程序设置错误，未设置信号采集；

(4) 试剂保存出现问题。

解决方案：

(1)阴性对照结果正常，待测样品检测阳性情况下，不影响结果判读，也可重新检测，上机前检查各孔位的液面高度是否一致；

(2) 定期检查确认移液器精准度；

(3) 确认仪器故障情况下，联系厂家检修仪器；

(4) 影响结果判读，需更换试剂重新检测。

2.1前端鼓包/前几个循环有波动

原因分析：

(1)试剂未充分混匀；

(2)样本中杂质过多。

解决方案：

(1)上机前充分混匀，然后离心去除管内气泡；

(2)将样本离心后取上清液进行提取或者将样本稀释10倍后重新检测，尽量避免使用杂质过多的样本。

2.2扩增曲线从基线期上飘

原因分析：

(1)仪器默认基线期范围较小，导致仪器默认从基线期就开始扩增；

(2)如果都是同一孔位出现问题，则需进行仪器检修。

解决方案：

(1)可手动将基线范围调大，扩增曲线即可恢复正常；

(2)联系仪器厂家进行仪器检修，也可用棉签蘸取75%酒精在相应孔位进行擦拭，待酒精挥发后再用棉签蘸取ddH2O擦拭。

3.1终点荧光较低，且CT值较小

原因分析：

A2样本存在扩增抑制。可能是样本本身存有(或因取样过多、纯化度不够，核酸残留)过多抑制物如结构蛋白、脂肪、多糖等。

解决方案：

将样本稀释10倍后重新检测(抑制物的影响可通过稀释样本消除)。

在出现异常曲线之后，需要按照“人为因素、仪器因素、样本因素、试剂因素、其他因素”的思路进行逐一排查，任何结果仔细排查后都可以找到其原因，所以理清思路、具体原因具体分析是解决异常曲线的关键。

文章参考来源：诺唯赞动保, 生物制品圈.

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