水生动物病原体核酸提取各类样本的处理

样本类型

处理方法

虾苗、鱼苗、青虫、沙蚕(红虫）、鱿鱼

取适量样本放入均质袋，充分碾磨均质袋表面，使样本被充分磨碎。取30mg（约绿豆大小）碾磨后的样本至离心管中，加入700ul裂解液静置5分钟，12000rpm离心1分钟后，取上清液加入离心柱。

成虾

根据说明书取适量虾组织或部位，充分碾磨均质袋表面，使样本被充分磨碎。取30mg（约绿豆大小）碾磨后的样本至离心管中，加入700ul裂解液静置5分钟，12000rpm离心1分钟后，取上清液加入离心柱。

养殖水（清澈）

用孔径0.22µm水系滤膜（水系膜不易堵塞）进行过滤（滤膜可以截留细菌性病原体如EHP、弧菌（含EMS）等），过滤500mL以上养殖水后，取出滤膜，剪成小块后放入离心管中，加入700ul裂解液静置10分钟，12000rpm离心1分钟后，取上清液至离心柱中。

注：0.22um水系滤膜可以富集细菌包括EMS、玻璃苗以及胞子虫；病毒类（白斑、皮下、虹彩、桃拉、黄头等）支原体衣原体不能收集到。

养殖水（浑浊）

取1ml养殖水至离心管中，12000rpm离心2分钟，吸走液体，往沉淀中加入700裂解液，震荡1分钟，室温放置10分钟后，12000rpm离心1分钟，取上清液加入至离心柱中。

注：EMS/EHP含量太低，可以多次离心的方式增加富集量，3~4次即可。

    虾片、红料、

黑料、虾便

（水生动物病原体核酸提取试剂盒）

取适量样本充分研磨，研磨后取10mg（约米粒大小）均质液至离心管中（粉状虾片直接取10mg放进离心管），加入1.4ml裂解液后静置10分钟，高速离心1分钟，先吸取700µL上清至离心柱中，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，离心柱放回收集管中，把剩余的上清液全部加入离心柱中离心，再弃废弃液。

虾便

（水生动物粪便提取试剂盒）

①取200mg虾便至离心管中，加入500µLSDL缓冲液和15µL蛋白酶K（如果粪便较干情况下，可适当增加SDL缓冲液用量），充分碾磨或匀浆，70℃加热15min，期间摇匀2~3次，12000rpm离心3min，上清转移至新的离心管中；②加入与上清液等体积的SDB缓冲液后充分颠倒混匀后，分多次（每次不超过700µL）转移至离心柱内，12,000rpm离心1min，弃收集管内液体，离心柱放回收集管内，直到所有混合液通过此离心柱；③加入500µL   SDW 缓冲液，12,000rpm 离心1min，弃收集管内液体，离心柱放回收集管内；④加入500µL漂洗液，12,000rpm离心30s，弃收集管内液体，离心柱放回收集管内；（此步骤重复一遍）⑤12,000rpm离心3min，离心柱转移至新的1.5mL离心管；⑥加入30µL洗脱液至离心柱，室温放置3~5min，12,000rpm离心1min，离心管内液体即病原体核酸溶液，-20℃或-70℃保存备用。

丰年虫

取适量丰年虫充分研磨（去不去壳都可以提取核酸，不去壳的丰年虫更容易检出胞子虫）取30mg研磨后的丰年虫至离心管中，加入700ul裂解液静置5分钟，12000rpm离心1分钟后，取上清液加入离心柱。

注：丰年虫没有去壳的要在研磨钵里面研磨，然后取30mg到离心管内，去壳的可以跟虾苗一样放在均质袋研磨。

塘泥

①取约30~50mg塘泥（约绿豆大小）至离心管中，加入400µL   AL缓冲液和40µL蛋白酶K，涡旋震荡混匀；55℃加热30min，期间摇匀2~3 次；②12,000rpm 离心5min，然后将上清液全部转移至离心柱中；

③加入900µL SDW缓冲液，混匀后转移700µL混合液至离心柱内，12000rpm离心2min，倒弃收集管中滤液，离心柱放回收集管中；④重复“步骤③”直至将剩余混合液全部转移至离心柱内；⑤加入500µL   SDW缓冲液，12000rpm离心1min，倒弃收集管中滤液，离心柱放回收集管中；⑥加入500µL漂洗液，12000rpm离心1min，倒弃收集管中滤液，离心柱放回收集管中；⑦重复“步骤6”一次；⑧离心柱转移至新的离心管，开盖放置1~2min使酒精完全挥发，往离心柱中央悬空滴加30µL洗脱液，室温放置3~5min后，12,000rpm离心1min，离心管内液体即核酸溶液。