公司简介荣誉资质走进华峰公司新闻行业动态致病微生物检测系列试剂盒(恒温荧光法)致病微生物检测系列试剂盒(恒温显色法)致病微生物检测系列试剂盒(PCR-荧光探针法)致病微生物检测系列试剂盒动物源性检测系列试剂盒(恒温荧光法)动物源性检测系列试剂盒(实时荧光PCR法)动物源性检测系列试剂盒(PCR-荧光探针法)动、植物源性检测系列试剂盒猫疾病病原体检测系列试剂盒(PCR-荧光探针法)犬疾病病原体检测系列试剂盒(PCR-荧光探针法)猫犬共患疾病病原体检测系列试剂盒(PCR-荧光探针法)宠物疾病病原体检测系列试剂盒犬贫血相关病原体检测试剂盒套餐犬呼吸道症状疾病相关病原体检测试剂盒套餐犬蜱虫传播疾病相关病原体检测试剂盒套餐猫腹泻症状疾病相关病原体检测试剂盒套餐猫眼部疾病相关病原体检测试剂盒套餐猫繁殖性疾病相关病原体检测试剂盒套餐猫神经症状疾病相关病原体检测试剂盒套餐猫呼吸道症状疾病相关病原体检测试剂盒套餐猫口炎相关病原体检测试剂盒套餐粪便寄生虫检测试剂盒套餐宠物疾病症候群病原体检测试剂盒套餐水产养殖病害检测系列试剂盒(恒温荧光法)水产养殖病害检测系列试剂盒(PCR-荧光探针法)水产养殖病害检测系列试剂盒畜牧养殖病害检测系列试剂盒畜牧养殖病害检测系列试剂盒转基因农产品检测系列试剂盒(恒温荧光法)转基因农产品检测系列试剂盒益生菌检测系列试剂盒(恒温荧光法)益生菌检测系列试剂盒通用型试剂及酶系列核酸提取系列试剂盒(磁珠法)核酸提取系列试剂盒(离心柱法)核酸提取系列试剂盒(煮沸法)核酸提取系列试剂盒(其他类)核酸提取系列试剂盒仪器设备其它产品技术原理技术优势操作流程自主创新技术背景公司专利发表文献专利与文献公司倡导的标准技术交流技术培训售后服务区域代理寻求合作联系方式客户留言

荧光定量PCR入门介绍(含定量判断)

258
发表时间:2022-02-11 16:10
由于操作简单、快速、精准等的优点,荧光PCR方法检测病原体已成为常规的检测技术之一,但对于刚开始学习,缺乏经验的我们,心中或会有些疑问,比如荧光定量PCR技术是什么?荧光定量PCR曲线的每个参数代表什么?我们又怎样去分析扩增结果?不急,今天小编就帮你一一解答,带你入门。


实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR ),简称RT-qPCR,是通过对PCR反应的每一次循环产物荧光信号的实时监测,从而实现对起始模板定性及定量的分析的一种技术方法。

图1


扩增曲线的每个时期

基线期:扩增产物少,信号被背景信号掩盖;
指数期:PCR原料充足,产物以2n指数增长;
线性期:原料部分消耗后,产物增长速度下降;
平台期:原料接近耗尽,产物增长速度极慢甚至完全不增长。

荧光定量PCR里的几个重要参数
基线(Baseline):指在PCR扩增反应的最初的数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线的线。


阈值(threshold):一般将反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,一般设置是3-15个循环荧光信号标准差的10倍,荧光阈值设定在PCR扩增的指数期(默认阈值=基线(背景)信号标准差×10)。


CT值(Cyclethreshold):表示每个PCR反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。研究表明,各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多(即样本核酸浓度越高),CT值越小,反之亦然。


注意:只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物量的对数值与与起始模板量之间存在线性关系,我们可以在这个阶段进行定量分析。仪器上出现的CT值只能定性判断样本的阴阳性,定量分析需要运用标准曲线。)



图2

结果分析(如图2)

标准曲线:利用已知拷贝数的标准品,按10倍浓度稀释五个成梯度,做出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表CT值。


斜率:从线性方程上看,计算公式为斜率=-1/lg(1+扩增效率)。如果从标准曲线上得到斜率( -3.3),就可以算出扩增效率( 0.99)。一般来讲 PCR扩增效率在90%-110%都是可以用于数据分析的。效率低于 100%,是由于PCR 反应中存在抑制因素;而高于 100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。


相关系数R^2:用以反映变量之间相关关系密切程度的统计指标。相关系数在0.99以上,得到的斜率才比较有意义。当然,样本量一定要足够,比如做标准曲线时,最少要有四个点以上,即四个不同的初始浓度,结果才可信。

因此,我们只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线(标曲)上计算出该样品的起始拷贝数。


图3


浓度读取:不同仪器的浓度显示形式可能略有不同,如图3,天隆仪器是在分析界面的“结果数据”界面中显示,浓度表示检测样品的拷贝数。例如:1.733E +06表示1.733×106=1733000Copies/μl(拷贝数每微升),图中的浓度单位IU/ml是一个国际单位。


我司检测试剂盒检测灵敏度低至几个拷贝数,得到CT值结果后可直接导入标曲就能得到样品浓度。产品详情可通过华峰生物科技有限公司官网的产品中心进行了解,也可以直接向我们进行线上咨询哦~



背景资料


判断扩增曲线是否良好的指标:

1、曲线拐点清楚,特别是低浓度样本指数期明显,扩增曲线整体平行性好,基线平而无上扬现象,低浓度样本扩增曲线指数期明显。

2、曲线指数期斜率与扩增效率成正比,斜率越大扩增效率越高。

3、标准的基线平直或略微下降,无明显的上扬趋势。

4、各管的扩增曲线平行性好,表明各反应管的扩增效率相近。

好了,今天的分享就到这里,希望对你们有所帮助,感谢大家的观看~



资料参考来源:临床检验医学、世硕新语、医学检验沙龙、华大基因等

声明:注明来源的稿件均为转载,仅用于分享,如涉及版权等问题,请尽快联系我们,我们第一时间更正或删除,谢谢!


分享到:
在线客服
 
 
 
 
 工作时间
周一至周五 :9:00-17:30
周六至周日 :10:00-17:00
 联系方式
客服热线:020-32053606
技术售后服务:020-32299993
邮箱:sales@hfbiotech.com